In der Nacht, in der die Exponate des Naturhistorischen Museums lebendig wurden, hat Nachtwächter Larry Daley (Ben Stiller) gerade erst in einer grandiosen Schlacht das ehrwürdige Museum vor dem Chaos bewahrt und gerettet, da muss er sich von dem neuen Job schon wieder verabschieden. Alle Exponate müssen der neusten Technik, nämlich virtuellen Hologrammen, weichen und werden zur Archivierung ins Smithsonian National Archiv in Washington DC verschickt.

Doch nicht einmal 24 Stunden später bekommt Larry einen Anruf von einem seiner ehemaligen Museumsstücke: Cowboy Jedadiah (Owen Wilson) berichtet ihm, dass aus Versehen auch die Tafel von Ahkmenrah, die die Exponate nachts zum Leben erweckt, mit nach Washington geschickt wurde und damit nun das komplette Smithsonian in der Nacht Kopf steht. Larry reist eilig nach Washington DC, um sich dem Chaos zu stellen und seinen Freunden zu helfen.

Eine neue Nacht bricht herein und neben Altbekannten wie Präsident Teddy Roosevelt (Robin Williams) trifft Larry dabei auf weitere interessante Persönlichkeiten der Geschichte: den französischen Kaiser Napoleon Bonaparte (Alain Chabat), Albert Einstein (Eugene Levy), den Gangster Al Capone (Jon Bernthal) und den russischen Zaren Ivan der Schreckliche (Christopher Guest).

Tatkräftige Unterstützung bei diesem Kampf um die Rettung des bedeutendsten Museums der Vereinigten Staaten bekommt er von der attraktiven Flieger-Pionierin Amelia Earhart (Amy Adams), die, ebenfalls zum Leben erwacht, mit ihm versucht, den Tumult in Zaum zu halten...